小鼠肺血管内皮细胞是肺微循环的核心功能单元，参与气体交换、炎症调控及血管屏障维持。分离培养高纯度PMVECs是研究肺血管生理病理机制的关键技术，以下为常用方法概述。
一、细胞分离
1.材料准备：选取6-8周龄健康C57BL/6小鼠，麻醉后无菌取肺组织；消化试剂含0.1%Ⅱ型胶原酶、0.01%DNA酶Ⅰ及0.25%胰蛋白酶，37℃预温。
2.组织解离：肺组织剪碎后经胶原酶消化30min，机械吹打至单细胞悬液，1000rpm离心5min去碎片；红细胞裂解液处理5min去除红细胞，PBS重悬后过40μm滤网。
3.内皮细胞富集：利用内皮细胞特异性贴壁特性，将细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基预包被的培养皿，37℃、5%CO₂孵育1-2h，未贴壁的成纤维细胞等杂质经换液去除，贴壁细胞即为初步富集的PMVECs。
二、原代培养
贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后传代，采用含20%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素及1ng/mLVEGF的EGM-2MV专用培养基，每2-3天换液一次。细胞呈铺路石样生长，融合达80%-90%时可传代，一般可传3-5代保持表型稳定。
三、细胞鉴定
1.形态学观察：倒置显微镜下可见细胞为多边形或鹅卵石样，边界清晰，单层融合时无明显重叠。
2.免疫荧光标记：固定细胞后，用抗CD31（PECAM-1）、vWF（血管性血友病因子）或VE-cadherin（钙黏蛋白）一抗孵育，FITC标记的二抗显色，荧光显微镜下可见胞膜或胞质特异性阳性信号。
3.功能验证：DiI-Ac-LDL摄取实验（37℃孵育2h后胞内出现红色荧光颗粒）；管腔形成实验（Matrigel基质上形成网状管样结构）。
注意事项
分离过程需严格无菌操作，控制消化时间与温度以避免细胞损伤；鉴定时需设置同型IgG阴性对照，排除非特异性染色。该方法可获得纯度＞90%的PMVECs，适用于肺血管屏障、炎症及纤维化等研究。
更新时间：2025-12-11
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