小鼠脑微血管内皮细胞是研究血脑屏障（BBB）功能、药物递送及神经血管疾病的重要模型。然而，由于其分离和培养过程复杂，实验人员常面临细胞纯度低、存活率差、功能异常等问题。本文总结mBMECs培养中的常见问题，并提出相应的解决策略，以提高实验成功率。
1.细胞分离困难
问题
mBMECs的分离涉及脑组织消化、密度梯度离心和磁珠分选（如CD31/PECAM-1抗体标记），但常出现细胞得率低或杂质细胞（如周细胞、星形胶质细胞）污染。
对策
-优化消化条件：使用胶原酶/分散酶（Collagenase/Dispase）混合消化（37℃，1–2小时），避免过度消化损伤细胞。
-提高分选效率：采用两步分选法（如先CD31磁珠分选，再CD45阴性筛选）以去除白细胞污染。
-验证纯度：通过免疫荧光检测内皮标志物（Claudin-5、Glut-1）及污染标志物（α-SMA、GFAP）。
2.细胞贴壁与增殖不良
问题
mBMECs贴壁率低或增殖缓慢，可能与基质包被不当、血清质量差或培养条件不佳有关。
对策
-基质包被优化：使用纤维连接蛋白（Fibronectin,10μg/mL）或胶原IV（CollagenIV,50μg/mL）预处理培养皿，促进细胞附着。
-调整培养基：采用内皮细胞专用培养基（如EndoGRO-MV或DMEM/F12+20%FBS），并添加生长因子（VEGF、bFGF）。
-控制传代比例：传代时保持高密度（1:2或1:3），避免单细胞悬液过度稀释。
3.细胞形态与功能异常
问题
培养的mBMECs可能失去典型“铺路石”形态，或跨内皮电阻（TEER）下降，表明血脑屏障特性退化。
对策
-低氧条件培养：模拟体内微环境（5%CO₂+1–3%O₂），有助于维持紧密连接蛋白表达。
-共培养模型：与星形胶质细胞或周细胞共培养（Transwell体系），可增强屏障功能。
-定期检测功能指标：通过TEER测量（>200Ω·cm²为佳）及荧光素钠渗透实验验证屏障完整性。
4.微生物污染
问题
由于操作复杂或试剂污染，细胞可能遭遇细菌、真菌或支原体感染。
对策
-严格无菌操作：在超净台中使用抗生素（如青霉素/链霉素），但避免长期使用以防掩盖污染。
-定期检测支原体：采用PCR或Hoechst33258染色排查，污染时使用Plasmocin处理。
-分装试剂：培养基和血清分装保存，减少反复冻融污染风险。
5.传代后细胞衰老
问题
高代次（P>5）mBMECs易出现衰老，表现为增殖停滞或形态扁平化。
对策
-限制传代次数：优先使用低代次细胞（P3–P5），冻存早期批次备用。
-添加抗衰老因子：如烟酰胺（Nicotinamide）或抗氧化剂（NAC）延缓衰老。
-原代细胞替代：若需长期实验，考虑使用永生化mBMEC细胞系（如bEnd.3）。
更新时间：2025-07-25
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